**3T3-L1脂肪细胞诱导分化方案**

3T3-L1细胞是一种来源于小鼠胚胎成纤维细胞的细胞系，具备从快速分裂的前脂肪细胞向脂肪样细胞分化的能力。该细胞系最早由Green和Kehinde于1974年分离而成，因其在体外分化为类脂肪细胞的特性，广泛应用于研究脂肪细胞的分化及与肥胖、糖尿病等代谢性疾病的关系。

为了检测诱导效果，常用的方法包括油红O染色，这是一种经典的检测脂肪细胞脂滴积累的方法。油红O能够与细胞内的中性脂质特异性结合，形成红色脂滴，研究者可通过显微镜观察脂滴的形成，数量和大小的增加表明诱导分化成功。此外，也可通过检测脂肪细胞特异性基因（如PPARγ、aP2、LPL等）的表达水平来评估细胞的分化程度。

本指南将以六孔板为例，介绍3T3-L1细胞分化为脂肪样细胞的实验方案。

第一阶段：细胞培养

1. 将3T3-L1细胞以3×10³个/cm²的密度接种于六孔板中。

注意事项：

• 建议使用早代次的细胞以确保分化效果。
• 确保细胞铺板均匀，以避免分化不均匀和细胞漂浮。

2. 在DMEM高糖培养基中培养细胞，直至达到70%的汇合度，并每2-3天更换一次培养基。通常情况下，需加入10%的小牛血清或胎牛血清，以促进细胞的生长。待细胞汇合度达到90%时，即可进行分化诱导。

注意事项：

• 分化前的汇合度不应超过70%，以减少细胞死亡率。
• 高血清含量的培养基可以促进脂肪积累，而适宜的细胞密度是影响分化效果的关键。

第二阶段：分化诱导培养基配制

培养基的制备应在无菌环境下进行，MDI诱导培养基和胰岛素培养基需新鲜制备。

1. 制备储备溶液。在DMSO中制备IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。如使用冻干胰岛素，需根据说明书进行复溶。

2. 配置100mL MDI诱导分化培养基，成分如下：

• DMEM: 100mL
• IBMX（50 mM）: 1mL（最终浓度为5μM）
• 地塞米松（1 mM）: 100μL（最终浓度为1μM）
• 胰岛素: 加入至10μg/mL

第三阶段：3T3-L1细胞向脂肪样细胞的分化

1. 从培养箱中取出细胞培养板，去除DMEM培养基，并每孔添加2-3mL MDI诱导培养基（记为第0天）。

注意事项：

• 添加诱导剂时手法要特别轻，加液时尽量沿侧壁慢慢加入，以减少对细胞的冲击。
• 诱导培养基需提前在37℃预热，以降低对细胞的刺激。

2. 在第3天，去除MDI诱导培养基，并用2-3mL胰岛素培养基替换。

3. 到第6天去除胰岛素培养基并添加新鲜的DMEM。

4. 一般在第7-10天时，细胞将完全分化为脂肪样细胞。

5. 通过油红O染色或监测脂肪细胞标志物（如脂联素和FABP4）的表达来检测分化效果。

注意：饱和油红O染色液不容易着色，染色前需根据说明书稀释。

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