mRNA技术作为一种新兴的生物技术，展现出巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，环亚集团·AG88致力于推动这一技术的发展，为疾病的预防和治疗提供全新的思路。然而，mRNA技术的进步并非一帆风顺，最大的挑战之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的形成。dsRNA是一种具有免疫刺激作用的分子，可能引发机体的免疫反应，进而影响mRNA的安全性和有效性。因此，减少dsRNA的产生已成为mRNA技术领域亟待解决的关键问题。

传统的解决方案通常依赖繁琐的纯化工艺，但这些方法费用高、效率低且难以彻底去除微量的dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）的关键工具，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性，如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性，被视为dsRNA形成的重要因素。如何通过定向进化或理性设计对T7RNAP进行改造，已成为全球科研团队关注的焦点。

2024年3月3日，我们团队在FEBS Journal上发表了一项题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。研究结果表明，我们成功地通过工程化改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成，仅为野生型的18%，同时大幅提升了合成mRNA的整体效率和质量。这一进展为基因治疗和疫苗开发领域的跨越式发展奠定了基础。

在本研究中，我们创新性地结合了定向进化和半理性设计的方法，筛选出多个高效且低毒的T7RNAP突变体。这些突变体在减少dsRNA形成方面表现优异。我们构建了随机突变库，设计了一种可实时监测液滴内RNA产物的完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，在荧光激活液滴分选（FADS）技术的帮助下，实现了超高通量筛选。最终，选出了关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），其产生的dsRNA含量显著低于野生型。

此外，通过半理性设计方法，我们构建了十个单点饱和突变库，并借助微孔板筛选技术识别出具有潜在价值的突变体。在筛选过程中，使用了双探针技术，以增加5'-end探针的RNA产量检测。在筛选超过1000个突变体后，发现关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）的dsRNA产生量显著低于野生型，同时未对转录效率产生负面影响。

为进一步优化，我们基于上述突变位点构建了DNA重排文库，并通过微孔板筛选，最终获得了组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。进一步实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅测得0007ng/μg。这一结果不仅在体外实验中得到了验证，在细胞实验中也显示出显著的免疫原性降低，以及蛋白翻译效率提高。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，观察到最优突变体M11所产生的干扰素β（IFN-β）相关mRNA和蛋白表达量分别为野生型的97%和1293pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加且荧光强度稳定。这一结果表明，减少dsRNA的生成能够有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA治疗的潜力。

为深入探讨突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，突变体的dsRNA减少主要是由于其降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论依据。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的方法和思路，也为mRNA技术的发展注入了新的活力。通过减少dsRNA的形成，提升了mRNA的质量和安全性。依托此研究成果，环亚集团·AG88成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级别T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250U/μL)）。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等多个领域展现出广泛的应用潜力，预示着mRNA技术的进一步蓬勃发展，也为生物医学领域带来了更多的可能性。

想要获取文章全文或申请产品试用？请扫描下方二维码进行咨询！