一、原理 将Western Blot的原理与Southern和Northern杂交方法进行比较，其原理类型相似。Western Blot使用聚丙烯酰胺胶进行电泳，检测的对象为蛋白质。其“探针”是抗体，“显色”则是通过标记的二抗实现。经过PAGE分离的蛋白质样品被转移到固相载体（如硝酸纤维素膜）上，固相载体利用非共价键吸附蛋白质，同时保持电泳分离所产生的多肽类型及其生物活性。固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，结合特定抗体进行免疫反应，随后与酶或同位素标记的第二抗体反应，通过底物显色或放射自显影检测特定目的蛋白的表达。该技术广泛应用于蛋白质水平的表达检测，包括定性和半定量分析，是初步鉴定蛋白质最便捷、最通用的手段。Western Blot显色的方法主要有以下几种：i 放射自显影，ii 底物化学发光ECL，iii 底物荧光ECF，iv 底物DAB显色。当前大多数研究采用底物化学发光ECL方法，这种方法准备简单，原理清晰，利用HRP标记的二抗，反应底物为过氧化氢与鲁米诺，在HRP的催化下释光，从而感应出胶片并显现条带。

二、操作步骤 (一) 配胶 1. 首先，确保玻璃板洁净，最后用ddH₂O冲洗。将玻璃板的接触面向下倾斜，放在干净纸巾上晾干。可提前准备分离胶和浓缩胶（不含AP和TEMED），过滤保存于避光的4℃条件下，至少可存放一个月。使用前将其平衡至室温。为防止气泡生成，可在室温下增加10% AP（浓度根据分离胶浓度决定）和TEMED的浓度。 2. 封胶：在分离胶灌注2/3后，立即进行封胶，低于10%的浓度可用0.1%的SDS封胶，超过10%则用异/丁醇或异/戊醇。待胶凝后需用清水及ddH₂O洗净封胶液。 3. 在浓缩胶灌注一小时后，需小心拔除梳子，避免气泡进入梳孔造成变形。若上样孔变形，应用适当针头修正。等样品恢复至室温后方可上样。

(二) 样品处理 1. 对于培养的细胞（定性分析），在去除培养液后用温PBS冲洗2-3遍，随后加入200-300μl的1×loading buffer，并在100℃下加热1分钟。用细胞刮下细胞后在EP管中煮沸10分钟，必要时可进行离心处理。 2. 对于培养的细胞（定量分析），取细胞后用裂解液提取蛋白质，并进行超声破碎和离心。将所有样品调至相同浓度后加loading buffer直接上样。 3. 对于组织样品，使用适量裂解液进行匀浆处理，然后离心并取上清进行定量。

(三) 电泳 1. 在上样前确保胶板下的气泡被清除。 2. 将所有蛋白样品调整至相同浓度后上样，同时用1×loading buffer平衡泳道。以45V进行稳流电泳，当电压到达65V时转换为稳压电泳。 3.电泳结束时，电泳液配方为Tris-base和glycine的溶液。

(四) 转膜 根据需要选择湿转或干转的方法，确保使用合适的转移液，将NC膜进行适当浸泡。

(五) 封闭及杂交 膜从电转槽取出后，进行PBST或TTBS处理，随后在封闭液中缓慢摇荡一小时；一抗和二抗的结合需要选择合适的稀释和孵育条件。

(六) 发光鉴定 通常使用HRP-ECL法或AP-NBT/BICP法进行蛋白质的显色反应，其显色效果依赖于抗体的质量和二抗的用量。

三、注意事项 在蛋白条带不明显或过于淡时，可以通过适当延长洗涤时间和调整封闭条件来增强显色强度。

此外，NC膜可以重复使用，并在不同实验中进行杂交，相关步骤需进行适当的清洗与调整。

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