第一章：分子克隆实验概述

分子克隆技术是实验室常用的关键技术之一，研究者通过该技术能将DNA片段以体外重组的方式转入载体中，随后通过转化操作引入合适的宿主进行复制与扩增，最终筛选获得符合实验要求的载体克隆。

一、分子克隆实验方法

分子克隆研究通常需要将特定的DNA片段插入载体，形成重组质粒。根据不同实验目的，分子克隆技术可分为以下几类：

• 入门克隆：TA克隆、TOPO克隆。
• 定向克隆：同源重组、酶切连接（黏性末端双酶切反应）。
• 定点突变：碱基插入、缺失与改变。

1. 酶切连接

酶切连接是载体构建实验中最具标志性的技术，利用限制性内切酶（特别是Type II型限制性内切酶）和T4 DNA连接酶来完成DNA片段与载体的重组连接。限制性内切酶根据结构复杂度、识别序列和切割位点的特点分为四类，其中Type II型限切酶可识别特定的双链DNA序列，通过水解磷酸二酯键生成特定DNA片段（5’端带磷酸基团，3’端带羟基）。T4 DNA连接酶能催化相邻的5’磷酸基团和3’羟基末端生成磷酸二酯键。

在采用酶切连接方法构建载体时，需对载体和片段的酶切位点进行分析，选择载体中含有的特定酶切位点，而插入片段需不含有相应酶切位点。通过PCR方法在目的片段两端引入对应的酶切位点，利用限制性内切酶开展酶切反应，并对酶切产物进行纯化，最终使用T4 DNA连接酶进行连接。此方法在双酶切线性化时不仅能实现定向克隆，还能够更换所用载体，但选择合适的酶切位点可能会遇到困难，进而影响实验进程。

2. TA克隆

TA克隆是一种通过将PCR片段与带有3’-T突出末端的线性载体连接，经过转化与筛选步骤获得重组质粒的技术。Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性在双链PCR产物的3’末端添加一个A碱基，随后与含有3’-T的线性载体通过T/A配对和T4 DNA连接酶连接。该方法快捷、高效，但对于平末端产物的连接不兼容。

3. TOPO克隆

TOPO克隆利用拓扑异构酶的催化作用实现目的片段与线性载体的连接，经过转化与筛选得到重组质粒。拓扑异构酶I既具限制性内切酶功能，又能催化连接反应，链切割和形成共价键速度极快，因此可用于高效连接目的基因与载体DNA。

4. 同源重组

同源重组技术通过重组酶将两段具有一致末端序列的DNA片段重组，形成环形双链DNA。此方法不依赖酶切，可以针对目标载体和酶切位点选择，容易实现定向克隆，是一种快速、高效的重组技术。

5. 定点突变

定点突变是向目标DNA片段引入所需碱基变化的过程，包括碱基的插入、缺失与改变。现代定点突变系统如MutExpress基于ClonExpress快速克隆技术，有效解决了原有系统的模板需求量大和假阳性的问题，具有超高成功率。

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