感染预实验步骤

本文将以24孔培养板为例，详细介绍目的细胞与工具细胞的感染预实验。作为工具细胞，可选择293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其他适合的细胞系。所需实验材料包括培养基、24孔培养板、移液枪、枪头、EP管、细胞计数板、冰盒、废液缸等。根据目的细胞的特点，酌情使用Polybrene。

Day 1：准备细胞

将细胞培养至对数生长期后，使用胰酶消化并计数。根据计算，确保每孔接种5×10⁴个细胞，并添加500µL的细胞培养液。一般情况下，H1299和293T细胞在感染后的第三天可达到80%-90%的融合度。在接种目的细胞时，应根据细胞的生长情况调整接种量，以确保其在感染后第3天达到相应的融合度。

Day 2：准备慢病毒颗粒与感染

(1) 准备慢病毒颗粒：根据实验需求计算所需的慢病毒颗粒量，然后将冻存于-80℃的慢病毒颗粒取出，置于冰浴中融化。

(2) 感染目的细胞：

• 首先，从培养箱中取出细胞，并在显微镜下观察其生长状态及融合度。如细胞状态良好，则可继续实验。
• 用移液枪小心吸去24孔板中的旧培养液，并加入新的完全培养液。
• 按计算的比例，将慢病毒颗粒液加入细胞中，然后将培养板平置于工作台，轻柔混匀，采用划8字的方式。
• 混匀后，将细胞培养板放入37℃、5% CO₂的培养箱中过夜。

Day 3：更换培养液

经过12-16小时感染后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板中添加含5%灭活FBS（胎牛血清）的新培养液，继续培养。请注意，目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不应超过12小时的感染时间。

Day 4：继续培养细胞

在此阶段，继续观察细胞状态是否存在异常情况。

Day 5：评估慢病毒颗粒感染效率

最后，覆盖24孔培养板外壁以70%乙醇进行消毒，然后使用倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估算慢病毒颗粒感染的效率。若慢病毒颗粒所携带基因表达所需时间较长，建议在72至96小时后观测荧光表达。

依据荧光的结果，可以从MOI梯度中筛选出适合目的细胞的MOI值，为后续实验奠定基础。

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